海德体育二阳来袭! 最新Nature Reviews综述《新冠药物设计
栏目:公司新闻 发布时间:2023-06-03
 海德体育特别感谢国家自然科学基金(92269112,31871324,81730064)和国家科技重大专项(2018ZX10715004)的大力支持。中南大学公共卫生学院团队成员  李广迪,研究生导师,博士生导师,现工作于中南大学湘雅公共卫生学院,博士毕业于比利时鲁汶大学医学院,硕士就读于山东大学和西班牙马德里理工大学计算机学院,本科毕业于湖南大学数学系。主持6项国家/省级项目;近5年发表30

  海德体育特别感谢国家自然科学基金(92269112,31871324,81730064)和国家科技重大专项(2018ZX10715004)的大力支持。中南大学公共卫生学院团队成员

  李广迪,研究生导师,博士生导师,现工作于中南大学湘雅公共卫生学院,博士毕业于比利时鲁汶大学医学院,硕士就读于山东大学和西班牙马德里理工大学计算机学院,本科毕业于湖南大学数学系。主持6项国家/省级项目;近5年发表30余篇第一或通讯作者论文。

  新冠病毒的大流行,激发了科研领域的巨大努力,通过靶向新冠病毒和人类蛋白质以控制病毒感染的治疗策略,包括数百种潜在药物和数千临床试验。到目前为止,一些用于治疗新冠的小分子抗病毒药物(尼马特利韦-利托那韦、瑞德西韦和莫努皮拉韦)和11种单克隆抗体已经上市,大多数需要在症状出现后10天内给药。此外,重症或危重症新冠住院患者可能受益于先前批准的免疫调节药物治疗,包括糖皮质激素(如)、细胞因子拮抗剂(如托珠单抗)和 Janus 激酶抑制剂(如巴瑞替尼)。我们基于自大流行开始以来积累的研究成果以及具有抗冠状病毒活性的临床和临床前抑制剂的信息,总结了新冠药物发现的进展。我们还讨论了从新冠和其他传染病在药物再利用策略、泛冠状病毒药物的靶点、体外试验和动物模型以及平台试验设计方面的经验教训,以便在未来爆发时开发应对新冠、长新冠的治疗方法。

  作为2019年新冠肺炎(COVID-19)的病原体,严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2型(SARS-CoV-2)是已知的第七种从蝙蝠和啮齿动物等其他宿主传播到人类的冠状病毒。自2019年12月发现以来,SARS-CoV-2已在全球造成超过680万人死亡(见相关链接),使其成为人类历史上最致命的病毒之一。

  COVID-19大流行的影响反映在制定预防和治疗战略的广泛努力中。迄今为止,这些努力已在极短的时间内成功研制出多种疫苗,并在临床试验中对大量的潜在治疗方法进行了评估,其中一些也已进入市场(表1)。根据60年来抗病毒药物发现的经验教训,可以考虑两种类型的抗SARS-CoV-2药物。第一类靶向病毒蛋白(主要是病毒酶)以阻断病毒生命周期,如果靶点缺乏人类同系物,这种方法可能具有高选择性,但由于新出现的变体,其具有潜在的耐药性风险。第二种类靶向参与病毒生命周期的宿主蛋白(如参与病毒侵入的受体),可能表现出广谱抗病毒活性,但选择性低且安全性可能较差。此外,靶向人类蛋白质的药物,如免疫系统调节剂,对于解决宿主对病毒感染的有害应答(如“细胞因子风暴”和血栓形成)可能很重要。

  在大流行期间,对开发COVID-19药物的研究进行了广泛的审查,尽管由于新结果报告的速度非常快,这些审查很难长期保持及时。现在,根据过去3年积累的证据,我们有机会概括性地总结进展,思考仍然存在的需求和挑战,并深刻反思、吸取教训。在此海德体育,我们基于广泛搜索确定了在临床前和/或临床研究中已报告的700多种抗SARS-CoV-2药物(补充表1-3),对抗SARS-CoV-2的病毒和宿主的靶向药物进行了全面概述。我们重点介绍了免疫调节剂和抗凝剂的临床表现。我们还讨论了发现和开发此类药物的总体主题,包括药物再利用的优势和局限性、合适的疾病模型和临床试验策略。由于篇幅有限,鼓励读者查阅有关SARS-CoV-2疫苗,诊断,生物学和发病机制,急性和急性后综合征,免疫学和炎症,蛋白质结构和功能,新兴变种,以及针对其他冠状病毒的抗病毒药物的综述。

  SARS-CoV-2是冠状病毒科的一种包膜阳性单链RNA病毒。SARS-CoV-2基因组(图1)全长约29.9 kb,是RNA病毒中最大的基因组之一,可编码16种非结构蛋白(NSP1至NSP16)、4种结构蛋白(穗、包膜、膜、核衣壳)和9种辅助蛋白。病毒靶向抑制剂的开发旨在阻断SARS-CoV-2生命周期的不同阶段(图2),包括侵入(刺突抑制剂)、蛋白水解加工(主要的蛋白酶抑制剂、木瓜蛋白酶抑制剂)、RNA合成(NSP12至NSP16抑制剂)和组装(核衣壳抑制剂)。本节重点介绍在病毒生命周期的各个阶段针对这些病毒靶点的药物开发(图2)。

  抗病毒药物靶点如下方基因组图谱所示。辅助蛋白没有被映射。NiRAN,尼迪病毒RdRp相关核苷酸转移酶结构域;非结构蛋白;ORF;开放阅读框;SARS-CoV-2,严重急性呼吸综合征冠状病毒2型。

  a.严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)进入宿主细胞。病毒刺突蛋白与膜表面的血管紧张素转换酶2 (ACE2)结合(与钠依赖性中性氨基酸转运蛋白B0AT1结合)。Spike在S1/S2切割位点被furin切割,随后在S2 位点被细胞表面进入途径的跨膜蛋白酶丝氨酸亚家族(TMPRSS)蛋白酶或内体进入途径的组织蛋白酶切割 (详见图7)。

  b.病毒脱壳。(+ss)基因组RNA从病毒颗粒释放到宿主细胞中。基因组RNA被翻译成开放阅读框1a(ORF1a)和ORF1ab多蛋白(pp1a和pp1ab),随后被木瓜蛋白酶(PLpro)和主要蛋白酶(Mpro)切割以释放16种非结构蛋白(NSPs)。

  c.病毒RNA合成。数个NSP组装成复制转录复合物(RTC),在复制细胞器中复制和翻译病毒基因组RNA。

  d.病毒mRNA翻译。结构蛋白到内质网(ER)和高尔基体中成熟。辅助蛋白调节病毒-宿主相互作用和病毒发病机制。

  e.病毒组装。基因组RNA与结构蛋白一起被病毒核衣壳(N)包裹,用于病毒组装。

  g.病毒RNA触发宿主免疫信号通路,包括激活转录因子以产生细胞因子,如白细胞介素(IL)-6,趋化因子,如C-C基序趋化因子配体2(CCL2)和C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10),以及干扰素,如干扰素-α(IFNα)。

  h.过度产生和分泌可能导致细胞因子诱导的损伤,多器官衰竭,血栓形成或死亡。免疫细胞也提供正反馈以释放更多的细胞因子、趋化因子和干扰素。红色圆圈中的Ps表示磷酸化位点。dsRNA,双链RNA;E,包膜蛋白;IRF,干扰素调节因子;ISG,干扰素刺激基因;ISRE,干扰素刺激反应元件;JAK,Janus激酶;M,膜蛋白;NF-κB, 核因子-κB;ssRNA,单链RNA;STAT,信号换能器和转录激活器;UU...UU,聚尿苷。SARS-CoV-2的电子显微照片图像(由 C.S. Goldsmith 和A. Tamin提供)是从CDC公共卫生图像库中检索。

  SARS-CoV-2刺突是病毒粒子表面的一种同源三聚体I类融合糖蛋白,是病毒侵入所必需的,使其成为了一个有吸引力的抗病毒靶点。在大多数情况下,刺突蛋白被宿主蛋白酶切割成受体结合亚基S1和膜融合亚基S2,被N -链和O-链聚糖严重屏蔽。经过主要的构象重排后,SARS-CoV-2刺突的受体结合域(RBD)与细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)具有高亲和力,几乎是SARS-CoV刺突对ACE2的亲和力的22倍。随后的结构转变和蛋白水解裂解驱动三螺旋束的融合后构象,使病毒膜与宿主质膜融合。已经开发了几种类型的药物来抑制刺突-ACE2相互作用或膜融合,包括中和抗体,小分子抑制剂和肽抑制剂。

  市场上有100多种单克隆抗体(mAb)用于治疗人类疾病,包括一些用于病毒感染的单克隆抗体,如用于呼吸道合胞病毒的帕利珠单抗和用于埃博拉病毒的安苏威单抗。到目前为止,少数抗SARS-CoV-2单克隆抗体和单克隆抗体混合物已获得批准或授予紧急使用授权(EUA),包括贝特洛维单抗、索特罗维单抗、瑞丹维单抗、巴姆拉尼单抗加依替维单抗、西加维单抗加替沙吉单抗、卡西利单抗加伊地维单抗和阿莫珠单抗加罗鲁塞维单抗(表1)。大多数单克隆抗体和单克隆抗体混合物已被授权作为早期治疗选择,用于治疗轻度至中度COVID-19门诊患者。随着SARS-CoV-2变异株的不断出现,不再推荐使用大多数单克隆抗体(框1),需要继续评估其疗效。

  已报告了300多种抗SARS-CoV-2单克隆抗体,包括20多种临床试验候选抗体(补充表2)。这些候选药物主要是通过筛选暴露于SARS-CoV-2的恢复期患者或人源化小鼠的记忆B细胞中的抗体来鉴定的(图3a)。有效的野生型单克隆抗体随后可以在片段结晶区(Fc)进行氨基酸修饰,以开发具有更长的半衰期和增强的效应功能的单克隆抗体。常见的片段结晶区修饰包括:L234A+L235A的LALA 修饰;M252Y+S254T+T256E的YTE修饰;M428L+N434S的LS修饰;L234F+L235E+P331S的TM修饰;以及G236A+A330L+I332E的GAALIE修饰(图3b)。例如,COV2-2130和COV2-2196是两种协同的IgG1κ单克隆抗体,采用YTE修饰(延长半衰期)和TM修饰(降低Fc效应功能),开发了西加维单抗和替沙吉维单抗。尽管所有已上市的抗SARS-CoV-2抗体都是IgG1单克隆抗体(补充表2),但人们对开发SAB-185和XAV-19等多克隆抗体,VHH-E、Nb12和XG014等纳米抗体以及恩索维贝普等生物合成蛋白的兴趣也越来越大(补充表2)。最后,作为抗SARS-CoV-2多克隆抗体的天然来源,来自COVID-19幸存者的高效价恢复期血浆可能提供被动免疫疗法。然而,目前的证据并不普遍支持恢复期血浆在COVID-19标准治疗中的疗效,其广泛使用也带来了重大挑战,包括供应有限、行政和后勤障碍以及SARS-CoV-2感染的抗体依赖性增强。

  a,单克隆抗体(mAb)的筛选。从暴露于严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)的恢复期供体或人源化小鼠中收集外周血单个核细胞(PBMCs)。单细胞培养的血浆或记忆B细胞准备筛选有效的单克隆抗体。

  b,片段结晶(Fc)-修饰单克隆抗体Fc结构域氨基酸的工程方法,以提高半衰期并降低效应函数。常见的修饰如LALA、TM、LS、YTE和GAALIE,其野生型残基利用人类IgG1 Fc (PDB: 4X4M)的结构可视化,其在选定单克隆抗体中的应用如下图所示。

  c,单抗与预融合尖峰三聚体配合物的结构。Bamlanivimab(PDB:7KMG)阻断血管紧张素转换酶2(ACE2)与刺突受体结合域(RBD)(PDB:6M17)的结合。

  d,根据它们与刺突RBD的相互作用,可以定义四类抗体。图中显示了每类的代表性抗体,包括阿莫巴维单抗(1类,PDB:7CDI),bamlanivimab(2类,PDB:7KMG),S309(3类,PDB:7TNO)和CR3022(4类,PDB:6W41)。

  e,来自多个类别的抗体可以联合抑制SARS-CoV-2变体。SARS-CoV-2变异株在RBD中含有氨基酸替换(如,奥密克戎变异株中的15个突变),这可能会阻碍抗体效力。世卫组织提供的最早记录样本的时间线(见相关链接)显示,病毒从SARS-CoV-2原始毒株进化到如今的十多个变种,包括阿尔法(B.1.1.7)、贝塔(B.1.351)、伽马(P.1)、德尔塔(B.1.617.2)、厄普西隆(B.1.427/B.1.429)、泽塔(第2页)、埃塔(B.1.525)、θ(第3页)、艾奥塔(B.1.526)、卡帕(B.1.617.1)、拉姆达(C.37)、穆(B.1.621)和奥密克戎(B.1.1.529)。来自1类的Omi-18、来自2类的Omi-31和来自4类的纳米抗体C1的三抗体组合可以同时靶向奥密克戎变异株(PDB:7ZFB)的一个RBD。Fab,片段抗原结合。

  抗刺突抗体通过两种主要机制减轻SARS-CoV-2感染。一种是病原体中和,其中与刺突结合的抗体,特别是与RBD 结合的抗体,阻止病毒进入。在COVID-19恢复期血浆中,rbd结合抗体约占中和抗体滴度的90%。另一种机制是抗体效应功能,其中抗体通过调理途径、补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞吞噬作用和细胞毒性介导 SARS-CoV-2 病毒粒子或感染细胞的破坏。迄今为止开发的抗体主要靶向RBD以阻断刺突-ACE2相互作用(图 3c),除了少数药物如COV2- 3434、S3H3和4A8靶向刺突RBD外的表位(补充表2)。RBD结合抗体根据其靶向的表位可分为四类(图 3d)。针对非重叠表位的来自不同类别的中和抗体可能组合成混合物,以提高对SARS-CoV-2变体的效力(图3e)。依替维单抗(1类)加巴姆拉尼单抗(2类)和卡西利单抗(1类)加伊德维单抗(3类)等抗体混合物已经上市。

  出于多种原因,开发针对SARS-CoV-2变体和多种不同沙贝病毒的广泛中和抗体仍然具有挑战性。首先,SARS-CoV-2刺突蛋白具有高度可变性,能够出现耐药突变。大多数现有的抗刺突抗体对值得关注的奥密克戎变异株(如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.4和BA.5)的活性或无活性,其刺突包含30个氨基酸取代,其中至少15个位于RBD中(图 3e)。为了对抗中和逃逸,重要的是开发针对刺突RBD内外高度保守的非重叠表位的强效抗体及其组合。其次,基于抗体的疗法可能会为某些疾病早期患者或无法检测到抗sars - cov -2抗体的患者提供临床益处,但对于已经产生内源性抗体反应的住院患者来说,益处可能有限。例如,巴姆拉尼单抗(LY-CoV555)由于对COVID-19住院患者的益处有限而过早退出了ACTIV-3试验(NCT04501978)。抗体疗法是否对治疗重症COVID-19有益仍在研究中。第三,抗SARS-CoV-2抗体的血清滴度随时间推移而降低,RBD靶向抗体可能仅保护几个月。广泛中和超级抗体和通过脂质纳米颗粒包封的mRNA编码的抗体可能具有提供长期保护的潜力。最后,需要静脉或肌肉内输注中和抗体,其严格的储存和分配要求以及高昂的生产成本是限制生活在医疗设施差的资源有限地区的患者获得中和抗体的重要因素。

  已经对氯法齐明等可能抑制SARS-CoV-2峰值的小分子进行了研究(补充表1),但到目前为止,尚未报告后期临床试验的结果。与刺突-ACE2相互作用的潜在小分子抑制剂,如MU-UNMC-2、P2119、P2165、H69C2、DRI-C23041和AB-00011778(补充表1),需要进一步优化才能进入临床试验。

  姜世勃教授的团队首次报告了几种有效的抗刺突肽抑制剂,这些抑制剂来源于SARS-CoV-2,严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV),中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和HIV-1棘突的七重复α-螺旋区。EK1 是一种源自 SARS-CoV-2 七肽重复序列 2 区的 36 个氨基酸泛冠状病毒融合肽抑制剂,目前正处于 I 期 COVID-19 试验。尽管抗病毒肽抑制剂具有显著的效力和低毒性,但口服生物利用度低、代谢不稳定和循环时间短可能限制了它们的应用。抑制HIV-1侵入的恩夫韦肽是唯一FDA批准的抗病毒肽,但现在很少在临床实践中推荐使用。未来的研究需要确定具有更好的药代动力学/药效学(PK / PD)特性和给药途径的肽抑制剂。

  木瓜蛋白酶(PLpro)是一种半胱氨酸蛋白酶,它不仅可以切割pp1a和pp1ab多蛋白以释放病毒蛋白NSP1,NSP2和NSP3(补充图 1a),还可以从信号蛋白中去除宿主泛素和泛素样干扰素刺激的基因15(ISG15)以抑制先天免疫反应。PLpro催化位点包含一个经典的催化三联体(Cys111-His272-Asp286),其优先切割相邻病毒蛋白(NSP1-NSP2,NSP2-NSP3,NSP3-NSP4)中的四肽基序LXGG↓XX以及细胞泛素和ISG15的C端尾巴(补充图1b)。在距离催化位点近 15 Å 处,一个被称为阻断环2 (BL2)的柔性β-发夹环控制着基质进入催化位点(补充图1b)。

  a,pp1a和pp1ab多蛋白中木瓜蛋白酶(PL pro)和主蛋白酶(Mpro)的切割位点。PLpro还切割ISG15和泛素的C端尾部,将它们从信号蛋白中去除,从而抑制先天免疫反应。

  b,SARS-CoV-2 PLpro的蛋白结构(PDB:7RBS)。底物基序LRGG位于具有催化三联体(Cys111−His272−Asp286)的活性位点。阻塞环路 2 (BL2) 的结构以红色表示。来自参考基因组的PL pro切割位点序列和BL2序列显示在右侧的框中。

  据报道,已有30多种有效的PLpro抑制剂(补充表1)。根据其作用机制,PLpro抑制剂可分为三组:(i)类,与催化半胱氨酸形成C-S硫醚键的共价抑制剂;(ii)类,阻止PLpro底物进入催化位点的非共价抑制剂;(iii)类,靶向变构结合口袋的非共价抑制剂(补充图 1c)。在(i)类中,共价抑制剂,如VIR250和VIR251是模仿四肽基序LXGG以抑制PLpro肽酶活性的拟肽剂。LXGG基序的“无特征”两个甘氨酸残基使得开发有效的拟肽抑制剂变得困难,因为只有P1和P2位置有两个甘氨酸残基的肽底物可以容纳在底物结合口袋内。在(ii)类中,非共价抑制剂如GRL0617、F0213、吖啶黄素、Jun9-72-2、Rac3k和XR8-24(补充表1)占据BL2槽以阻塞底物用于进入催化位点的通道。由于BL2沟的序列和结构差异,这些抑制剂中的大多数似乎只抑制SARS-CoV和SARS-CoV-2,而不能抑制MERS-CoV(补充图 1b)。F0213是一个例外,它抑制SARS-CoV-2和MERS-CoV PLpro,可能是通过靶向BL2槽66附近的狭窄底物结合袋。在第(iii)类中,HE9等非共价抑制剂靶向变构口袋(距离催化位点30 Å),以阻止ISG15和泛素与PLpro的结合(补充图1c)。双硫仑等锌-喷射药物阻断PLpro的变构Zn2+结合口袋。应广泛评估变构PLpro抑制剂的选择性和毒性,因为锌喷射剂可能会干扰人体内的含锌蛋白,并且ISG15结合口袋也存在于人泛素特异性肽酶18(USP18)中。

  PLpro抑制阻断病毒蛋白成熟并恢复人体免疫反应。然而,选择性PLpro 抑制剂的设计具有挑战性,部分原因是PLpro在结构上类似于人类去泛素化酶(DUB)和DUB样蛋白酶家族,它们也识别泛素或泛素样蛋白。也有DUB和DUB样蛋白酶作为其他人类疾病的治疗靶点的研究,但尚未批准这些蛋白质的抑制剂。未来的发展可能集中在(ii)类非共价PLpro抑制剂上,并进行广泛的优化,可提高选择性和效力,并减少与人类同源DUB和DUB样蛋白酶的交叉反应。

  SARS-CoV-2主蛋白酶(Mpro),也称为3C样蛋白酶,是一种半胱氨酸蛋白酶,可切割pp1a和pp1ab多蛋白以将病毒蛋白NSP4释放至NSP16(图 4a)。抑制 Mpro介导的蛋白水解裂解可阻断关键病毒酶(如NSP12和NSP13)的成熟,从而阻断随后的病毒复制(图2)。SARS-CoV-2 Mpro 同型二聚体更倾向于水解 Gln↓(Ser/Ala/Asn) 的 P1 位置的谷氨酰胺残基(图 4a)。虽然没有已知的宿主蛋白酶具有与Mpro 相同的初级切割位点,但一些人半胱氨酸蛋白酶(如组织蛋白酶B,K,L和S)也可以在Gln残基的C端切割;因此,在开发Mpro抑制剂时需要考虑潜在的交叉特异性。

  图4:严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型主要蛋白酶及其药物结合口袋的结构

  a,严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)主要蛋白酶(Mpro)功能结构域、蛋白质结构和切割序列。Mpro 二聚体是活性形式(PDB:7VU6)。pp1a和pp1ab多蛋白中相邻NSP4和NSP5之间的切割序列“AVLQ↓SGFR”位于由Cys145和His41(PDB:7DVP)形成的Mpro 催化二元组中。 来自参考基因组的Mpro 切割序列如右图所示。

  b, Mpro催化位点处于预裂解状态,具有NSP4−NSP5裂解序列(PDB:7DVP)。 可以开发具有P1′弹头,P1,P2,P3和P4基团的Mpro抑制剂,以最大化Mpro的S1′,S1,S2,S3和S4亚位点的药物-受体相互作用。

  Mpro同源二聚体的每个亚基都具有一个催化二元组,其由位置145(Cys145)的亲核半胱氨酸和位置41(His41)的组氨酸残基形成。Mpro催化二元组催化Cys145硫代酸盐与底物P1谷氨酰胺75的主链羰基之间形成共价碳硫键(图 4b)。与HIV-1和丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶抑制剂的基于结构的合理设计类似,各种小分子Mpro抑制剂被设计为最大化药物受体相互作用,特别是通过与Mpro的S1 , S1, S2, S3和S4亚位的主链原子形成广泛的相互作用(图4b)。

  已有超过100种Mpro抑制剂被报道,包括主要候选药物,如nirmatrelvir,ensitrelvir和SIM0417(补充表1)。Mpro抑制剂可分为四组(图 4c)。基于其作用机制:类(i),与Mpro催化口袋共价结合的拟肽抑制剂;类(ii),通过共价相互作用阻断M pro催化袋的非拟肽抑制剂;类(iii),通过非共价可逆相互作用占据Mpro底物结合口袋的正构抑制剂;和 (iv) 类非共价抑制剂,靶向变构位点,主要破坏 Mpro 二聚体的形成。

  在(i)类中,拟肽共价抑制剂通常带有亲电弹头,如腈(如nirmatrelvir),酮(如PF-00835231),α-酮酰胺(如化合物13b-K),醛(如化合物18p)或迈克尔受体(如化合物N3),以与Mpro的催化Cys145形成共价键(补充表1)。Nirmatrelvir是一种拟肽剂,其含有与Cys145共价键合以实现可逆抑制的丁腈弹头(图4c)。在细胞培养中,Nirmatrelvir抑制所有7种人类冠状病毒(HCoV)野生型78和各种SARS- CoV-2变体,并显着降低小鼠和仓鼠的病毒载量。

  在II/III期EPIC-HR研究中,在高风险、未接种疫苗、未住院的轻中度COVID-19成人患者中,早期使用尼玛特瑞韦300毫克、加利托那韦100毫克,每日2次,持续5天,可降低COVID-19相关住院率(nirmatrelvir-利托那韦:0.77%,安慰剂:6.31%)和28天全因死亡率(nirmatrelvir-ritonavir:0%,安慰剂:1.15%)。根据EPIC-HR研究,利托那韦增强剂nirmatrelvir(作为Paxlovid上市)于2021年12月在美国获得了首个EUA,随后在许多国家获得批准或授权。现在推荐将Paxlovid作为轻度至中度COVID-19且进展为重度COVID-19高风险的门诊患者的早期治疗(表 1)。然而,初步研究表明,在Paxlovid治疗后,COVID-19偶尔会反弹,而Mpro中的E166V等自然发生的突变可能会赋予对nirmatrelvir和ensitrelvir 92的耐药性。不推荐Paxlovid用于有严重肾脏或肝脏损伤或有临床显着超敏反应史的患者,也不推荐用于服用引起显着药物相互作用的禁忌药物的患者。未来的研究应监测影响nirmatrelvir-ritonavir效力和安全性的耐药突变和药物相互作用(例如,与CYP3A4诱导剂)。

  由NSP12编码的SARS-CoV-2 RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)是一种高度保守的全酶,参与病毒RNA复制和转录。在Mpro介导的蛋白水解处理后,成熟的NSP12与病毒复制-转录复合物93中的其他非结构蛋白(NSP7至NSP10,NSP13至NSP16)配合(图5a),催化模板解旋、RNA合成、RNA校对和RNA加帽。通过靶向复制-转录复合物的关键成分(图5b)、可开发一系列抗病毒药物来阻断RNA合成(NSP12 RdRp 抑制剂)、模板展开(NSP13 解旋酶抑制剂)、RNA 校对(NSP14 外切核糖核酸酶抑制剂)、尿苷切割(NSP15 内切核糖核酸酶抑制剂)和 RNA 加帽(NSP9 抑制剂、NSP12 NiRAN 抑制剂、NSP13 ATP 酶抑制剂、NSP14 鸟嘌呤-N7-甲基转移酶抑制剂和 NSP16 2′-O-甲基转移酶抑制剂)。NSP12抑制剂将在本节中描述,而其他抑制剂将在后面讨论。

  步骤2:非结构蛋白12(NSP12)RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)和NSP14外切核糖核酸酶(ExoN)分别介导RNA合成和校对。

  步骤3:NSP15切割病毒单链RNA/双链RNA(ssRNA/dsRNA)中的尿苷,特别是阴性gRNA5′末端的长聚尿苷束,以避免宿主免疫防御。ss gRNA和mRNA的产物经历四步过程(步骤4-8),以完成病毒RNA加帽以逃避免疫。

  步骤4:NSP13 ATP酶水解并释放病毒RNA 94的5′-三磷酸的γ-磷酸盐。另一种途径是由RNA化NSP9介导。

  步骤5:NSP12 尼多病毒 RdRp 相关核苷酸转移酶结构域 (NiRAN) 将共价连接的鸟苷 5′-单磷酸转移到病毒 RNA 96 的 5′-二磷酸末端。

  步骤8:将加帽的RNA基因组易位以进行病毒包装,而其他加帽的mRNA则易位到宿主核糖体进行翻译。病毒RNA加帽过程步骤中涉及的RTC模型示意图如图底部所示。

  NSP12由用于病毒RNA加帽和其他活性的N端Nidovirus RdRp相关核苷酸转移酶结构域(NiRAN)组成动态结构域和用于病毒RNA合成的C端RdRp结构域(图 6a)。在病毒RNA加帽过程中,NiRAN结构域作为一种鸟苷转移酶,将鸟苷5′-三磷酸添加到病毒RNA 96的5′末端(图5b)。NiRAN活性位点可以被核苷(t)化物类似物阻断,例如三磷酸瑞德西韦和三磷酸贝尼福布韦(图6b)。然而,开发具有高特异性和低毒性的强效NiRAN抑制剂是一项挑战,因为NiRAN结构域与许多人激酶(例如胰岛素受体激酶,脾酪氨酸激酶和O-甘露糖激酶)具有显著的结构同源性。SARS-CoV-2 RdRp 活性位点是关键的药物靶标。与HIV逆转录酶抑制剂类似,RdRp抑制剂可分为具有不同作用机制的非核苷(t)类似物(如瑞德西韦、莫努匹拉韦、法匹拉韦和贝尼福布韦)和非核苷(酸)类似物(如舒拉明)(图 6c)。

  a,非结构蛋白12(NSP12)功能域(PDB:7EIZ)。NSP12 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RdRp) 和尼多病毒 RdRp 相关核苷酸转移酶结构域 (NiRAN) 催化位点用模板 RNA(青色)和产物 RNA(红色)突出显示。

  b,NiRAN结构域催化位点的药物结合口袋。ADP(PDB:7RDY)与NiRAN活性位点结合。AT-9010是贝尼福布韦的活性5′-三磷酸形式,可阻断NiRAN活性位点(PDB:7ED5)。

  c,RdRp 抑制剂包括核苷(t)类似物,例如三磷酸瑞德西韦 (PDB: 7B3C)、三磷酸莫努匹拉韦 (PDB: 7OZU)、法匹拉韦核糖核苷三磷酸 (PDB: 7AAP) 和非核苷(t)类似物,例如苏拉明 (PDB: 7D4F)。

  d, 使用ProTide方法从GS-441524开发瑞德西韦。指示产物病毒RNA(p-RNA)中新生碱基对的易位后位置(+1,-1至-4),天然核苷三磷酸(NTP)的底物活性位点位于-1位置。三磷酸瑞德西韦充当延迟链终止子,其氰基与RdRp的S861发生冲突以阻止RNA合成。体外半数最大有效浓度(EC50)和半衰期值。

  e,由莫努匹拉韦引起的致死性诱变,其在细胞内转化为活性三磷酸形式(EIDD-2061),增加了基因组RNA(gRNA)中G到A和C到U转换错误的频率。RTC,复制-转录复合体。

  瑞德西韦(GS-5734)最初于2013年合成,用于寻找呼吸道合胞病毒的有效核苷抑制剂。为了改善其细胞内递送并绕过限速的第一个磷酸化步骤,通过添加氨基酸酯和芳氧基取代的磷酸基团,将瑞德西韦合成为其母体核苷(GS-441524)的单磷酰胺前药。这种前药方法称为“ProTide”(图6d),已用于两种FDA批准的抗病毒药物:HIV逆转录酶抑制剂替诺福韦艾拉酚胺和HCV NS5B聚合酶抑制剂索非布韦。瑞德西韦扩散到细胞膜后,经历一系列代谢转化,生成活性代谢物三磷酸瑞德西韦。

  在2014-2016年埃博拉病毒暴发期间,瑞德西韦被确定为一种有效的抗埃博拉抑制剂,但由于对埃博拉感染患者的益处有限,因此没有使用瑞德西韦。COVID-19 爆发后不久,其抗 SARS-CoV-2 的潜力在临床前和临床研究中得到了证实。作为ATP的类似物,三磷酸瑞德西韦与天然ATP底物竞争,以有效地结合到新生的RNA链中,导致易位后位置的链终止延迟-3(图6d)。这种阻断是由三磷酸瑞德西韦的1′-氰基与Ser-861侧链的空间位阻冲突介导的(图 6d)靠近RdRp催化位点。瑞德西韦的1′-氰基和C-连接核碱基对其抗冠状病毒活性至关重要。

  瑞德西韦于2020年5月获得FDA授予在特定条件下治疗COVID-19的EUA,随后在许多国家获得批准或授权。随机试验(如ACTT-1(NCT04280705)和PINETREE(NCT04501952))表明,瑞德西韦与安慰剂或标准治疗相比具有临床益处,而在团结和DisCoVeRy中没有瑞德西韦的附加值。尽管存在各种因素(如患者状况、研究设计和治疗时间)的影响,但人们普遍认为,瑞德西韦早期治疗可降低病毒载量并改善某些COVID-19患者的康复情况,尤其是在门诊给药时。瑞德西韦不适合口服给药和肺特异性给药,因为它的口服生物利用度低,在人肝微粒体中稳定性低。这些缺陷可以通过开发瑞德西韦母体的口服前药来解决,例如VV116(在乌兹别克斯坦获得批准,在中国有条件批准)、GS-5245(目前正在进行III期试验:NCT05603143)、ODBG-P-RVn、ATV006和GS-621763,所有这些都具有良好的口服生物利用度、相对简单的结构和有效的抗SARS-CoV-2活性(补充表1)。一项随机 III 期试验显示,口服 VV116 与尼玛瑞韦-利托那韦在缩短有症状的轻度至中度 COVID-19 住院患者持续临床恢复时间方面的非劣效性。

  莫努匹拉韦(EIDD-2801,MK-4482)是β-d-N4-羟基胞苷(EIDD-1931)的口服前药。 早已知道N4-羟基胞苷具有诱变特性,主要增加AT到GC的转变误差。莫努匹拉韦是一种诱变性核糖核苷类似物,最初开发是用于抑制甲型和乙型流感病毒。2020年初,对现有化合物的重新利用筛选导致发现莫努匹拉韦在细胞培养物和动物模型中具有针对SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的广谱活性。在针对未接种疫苗的轻中度 COVID-19 门诊患者的 III 期 MOVe-OUT 试验中,6.8% (48/709) 的莫努匹拉韦治疗患者和 9.7% (68/699) 安慰剂治疗的患者发生了主要终点事件(第 29 天住院或死亡)。莫努匹拉韦于 2021 年 11 月在英国首次获得批准,此后已在许多国家上市。2022 年,平台自适应 PANORAMIC 试验报告称,莫努匹拉韦加常规护理在症状出现后 5 天内减少高风险接种疫苗的成年人与 COVID-19 相关的住院或死亡方面没有益处。一项大规模的真实世界研究也显示,莫努匹拉韦在降低疫苗接种不全的高风险门诊患者的住院率方面没有益处。

  莫努匹拉韦通过一种称为致命诱变或错误突变的机制诱导病毒RNA基因组中错配核碱基的致命积累(图6e)。第一步,莫努匹拉韦转化为其活性代谢物β-d-N 4-羟基胞苷5′-三磷酸(EIDD-2061),由于碱基对不明确,可以识别为胞嘧啶或尿苷三磷酸。在第二步中,其活性代谢物与天然胞嘧啶或尿苷三磷酸竞争,以结合到病毒模板链中,从而增加病毒RNA基因组中G-to-A和C-到U转换错误的频率。然而,莫努匹拉韦诱导的诱变需要全面的安全性评估,因为诱变核糖核苷类似物也可能对哺乳动物细胞中的细胞DNA合成产生不利影响。莫努匹拉韦仅被批准用于短期使用(连续 ≤5 天),不推荐用于孕妇或年轻患者(18 岁),因为存在胎儿毒性以及骨和软骨毒性的潜在风险。此外,根据定义,致命诱变将增加病毒序列多样性。目前尚不清楚莫努匹拉韦是否会加速SARS-CoV-2的进化以逃避当前的疫苗和抗病毒治疗。还有其他诱变核苷类似物,例如法匹拉韦,利巴韦林,嘧啶,嘌呤和吡嗪衍生物,其活性代谢物也参与错误的氢键和碱基对。致死诱变剂如果它们的错配可以局限于病毒RNA,则可能导致较少的不良事件。

  法匹拉韦(T-705)在日本被批准用于流感治疗,是一种嘌呤N-核苷类似物前体,对许多RNA病毒表现出广谱活性。法匹拉韦核糖核苷三磷酸可以并入病毒RNA引物链中以抑制SARS-CoV-2 RNA合成,但只有大剂量法匹拉韦才能降低叙利亚仓鼠的SARS-CoV-2病毒载量。在随机、双盲、安慰剂对照研究中,法匹拉韦在改善轻度、轻度至中度或无症状或无并发症的COVID-19门诊患者的病毒清除率方面没有显着益处。在III期JIKI试验中,法匹拉韦血浆浓度随着时间的推移而下降,其低于预期的浓度未能改善高病毒载量埃博拉感染患者的临床结果。低血浆浓度的法匹拉韦(半衰期:2-5.5小时)可能不足以抑制人肺细胞中的SARS-CoV-2。尽管法匹拉韦在几个国家(包括日本、印度和俄罗斯)紧急使用,但世卫组织或FDA目前不建议使用抗SARS-CoV-2的法匹拉韦(框1)。

  贝尼福布韦(AT-527,RO7496998)最初设计用于抑制HCV,是鸟苷核苷酸类似物AT-9010的前药,显示出抑制SARS-CoV-2 RdRp和NiRAN的双重机制。目前正在 III 期 SUNRISE-3 试验 (NCT05629962) 中评估口服贝姆尼非布韦与安慰剂在 COVID-19 高风险门诊患者中的有效性和安全性。加利西韦是一种腺苷 C 核苷类似物,在一项针对 24 名中度至重度 COVID-19 住院患者的 I 期研究中显示获益有限 (NCT03891420),并且没有进一步进展。在其他具有体外活性的NSP12抑制剂(如6-72-2a,5-碘虫菌素,HeE1-2Tyr,5-羟甲基结核菌素)中(补充表1),一些具有明显的局限性需要解决。例如,桑吉霉素是一种实验性N-核苷类似物,对许多SARS-CoV-2变体133表现出体外活性,但靶向细胞蛋白,包括蛋白激酶C和组蛋白H3相关蛋白激酶。Suramin阻断RdRp催化位点内病毒RNA模板链的结合(图 6c)并抑制Vero E6细胞中的SARS-CoV-2复制。然而,苏拉明从未被推荐用于抗病毒药物,因为它的生物利用度差和强烈的副作用(带负电荷的苏拉明与许多带正电荷的表面的人类蛋白质结合)。

  SARS-CoV-2解旋酶是1B解旋酶超家族的成员,具有RNA解绕和腺苷5′-三磷酸酶(ATPase)活性。解旋酶结构包括一个协调锌离子的N端锌结合结构域;具有两个RecA样结构域的C端RNA结合ATP酶;以及桥接N端和C端结构域的茎和1B结构域。螺旋柄和1B结构域的动态结构不太可能是可成药的,但RNA结合位点和ATP酶活性位点(补充图 2)已被鉴定为保守的药物结合口袋。

  NSP13解旋酶的功能域(PDB:7RDY)。一个药物结合口袋位于ATP/ADP结合位点内,腺苷酰亚胺二磷酸(一种不可水解的ATP类似物)阻断ATP/ADP结合位点(PDB:7NN0)。另一个位于RNA结合位点内,实验抑制剂POB0066阻断病毒ssRNA的进入(PDB:5RMM)。

  据报道,一些小分子先导物可抑制解旋酶RNA展开(如FPA-124和2-苯基喹啉衍生物)和/或ATP酶活性(如5645-0263和雷尼替丁柠檬酸铋)(补充表1)。然而,需要进一步优化以解决脱靶毒性和效力有限的问题,因为SARS-CoV-2和一些宿主解旋酶(如人DDX解旋酶)具有相似的底物结合结构和功能,包括双链RNA展开和NTP酶水解。尽管尚未有解旋酶抑制剂进入COVID-19的临床试验,但已经开发出针对其他传染病的强效解旋酶抑制剂,包括在日本被批准用于带状疱疹治疗的amenamevir和普利特利韦,该试验正在招募感染阿昔洛韦耐药单纯疱疹病毒的免疫功能低下患者(NCT03073967)。

  SARS-CoV-2 NSP14具有N端外切核糖核酸酶结构域和C端鸟嘌呤-N7-甲基转移酶结构域(补充图 3a)进行病毒RNA校对和加帽,分别为NSP14的外切核糖核酸酶结构域与其辅因子NSP10相互作用,作为3′–5′外切核糖核酸酶,通过从新生RNA链的3′末端去除错误并入的核苷酸或核苷酸类似物来纠正病毒RNA错配。这种校对机制对于维持长SARS-CoV-2基因组的复制保真度是必不可少的。它还限制了利巴韦林等核苷(t)ide抑制剂的有效性,因为NSP14外切核糖核酸酶从病毒RNA中快速切除利巴韦林5′-单磷酸。靶向外切核糖核酸酶活性位点的NSP14抑制剂已被鉴定,例如化合物#79,A-2和B-1(补充表1),但由于NSP14和人DEDD核酸外切酶之间的结构相似性,应仔细评估这些抑制剂的脱靶效应。

  b,NSP14甲基转移酶将甲基从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转移到其底物病毒GpppA 1-RNA,在病毒RNA加帽过程中产生m 7GpppA 1-RNA(参见图5b中的所有过程)。

  NSP14鸟嘌呤-N7-甲基转移酶参与病毒RNA帽结构的构建,该结构可防止病毒RNA降解和抗病毒免疫激活。它将甲基从S-腺苷基-l-蛋氨酸(SAM)供体转移到新合成的病毒RNA的鸟苷5′-三磷酸的N7位置,产生Cap-0-RNA结构(补充图 3b)。基于磺酰胺的双底物类似物化合物含有用于阻断SAM结合口袋的腺苷和用于占据帽结合口袋的3-氰基-4-甲氧基苯磺酰胺环。其他N7-甲基转移酶抑制剂(如吡啶抑素、西尼芬苷和DS0464)在细胞培养中也表现出适度的抗SARS-CoV-2活性(补充表1)。目前尚无NSP14抑制剂进入COVID-19的临床试验。

  NSP15是一种尿苷特异性内切核糖核酸酶(补充图4a)在负义病毒RNA中切割5′-聚尿苷束(补充图4b)逃避宿主免疫反应的激活。NSP15 Mn2+依赖性核糖核酸内切酶的活性位点,其切割病毒RNA底物并产生2′,3′-环磷酸二酯和5′-羟基末端是一个潜在的药物结合口袋(补充图 4c)。迄今为止确定的抑制剂(补充表1),例如替匹嘧啶,一种被批准用于治疗结直肠癌的尿嘧啶衍生物,对SARS-CoV-2的活性较弱(补充图4d),需要进一步优化。理论上,NSP15内切核糖核酸酶可能是一个有吸引力的抗病毒靶标,因为缺乏密切的人类同系物。

  a海德体育,NSP15单体的功能结构域由N端结构域,中间结构域和C末端核糖核酸内切酶(endoU)结构域组成。NSP15催化位点位于endoU结构域内。

  b, 六个NSP15单体形成一个六聚体(PDB:7TQV),可识别尿苷并从双链或单链病毒RNA中切割聚尿苷尾巴。

  c, NSP15六聚体的一个亚基靶向双链RNA的尿苷(PDB:7TQV)。

  d, NSP15药物结合口袋被称为替匹嘧啶(PDB:6WXC)的尿嘧啶衍生物阻断。

  SARS-CoV-2 NSP16及其激活剂NSP10形成异二聚体2′-O-甲基转移酶复合物(补充图 5)有效地将病毒RNA从Cap-0-RNA转换为Cap-1-RNA配置,以逃避模式识别受体的激活。尽管S-腺苷-l-高半胱氨酸(SAH)和SAM衍生物(例如sinefungin)在细胞培养中具有抗SARS-CoV-2活性,但通常具有较差的膜通透性(由于其两性离子性质)和高毒性(由于人类甲基转移酶,例如帽特异性mRNA(核苷-2′-O-)-甲基转移酶1(CMTR1)),因此限制了其临床应用。

  b, NSP16的催化位点通过将甲基从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转移到底物Cap-0-RNA上,使新生SARS-CoV-2 RNA 中第一个核苷酸(通常是腺苷)的核糖2′-O甲基化。

  c, NSP16催化位点内的药物结合口袋。Sinefungin模仿SAM结构以 竞争性阻 断病毒RNA加帽的2′-O甲基化(PDB:6YZ1)。

  NSP16 与人 CMTR1 具有结构同源性,可促进 SARS-CoV-2 RNA 甲基化作为替代途径。一种称为 3-脱氮烷匮菌素 A 的实验性腺嘌呤类似物通过协同阻断 NSP16 2′-O-甲基转移酶和人 CMTR1 来抑制 SARS-CoV-2 复制 ,但会引起不良影响,例如啮齿动物生长迟缓和肾毒性。原则上,抑制 SARS-CoV-2 RNA 甲基化需要同时靶向 NSP16 和 CMTR1,并且可能具有很高的毒性风险,因为抑制人 SAM 循环相关酶会损害人类 mRNA 成熟。

  SARS-CoV-2核衣壳是一种灵活的多价蛋白(补充图6)海德体育,具有多种功能,包括病毒基因组包装153 和抑制先天抗病毒免疫。然而,开发核衣壳抑制剂仍然是一个挑战。首先,与病毒蛋白酶和RdRp不同,核衣壳中的药物结合口袋似乎是动态结构,因此难以进行稳定的药物结合。其次,核衣壳是最丰富的SARS-CoV-2蛋白,并与病毒RNA折叠成复杂的核糖白复合物。第三,目前的核衣壳抑制剂在抗病毒效力和结合亲和力方面不如蛋白酶和RdRp抑制剂。尽管在过去30年中进行了积极的研究,但尚未批准抗病毒核衣壳抑制剂。

  b, 与病毒单链RNA复合的RNA结合结构域(PDB:7ACT)。实验抑制剂PJ34(PDB:4KXJ)的药物结合口袋位于RNA结合结构域和病毒ssRNA之间的相互作用界面内。

  c, SARS-CoV-2核衣壳二聚体与GTP复合物的二聚结构域(PDB:7O35)。假设的药物结合口袋位于两个亚基之间。病毒RNA包装是通过核衣壳二聚体、病毒基因组RNA和病毒膜蛋白的寡聚化介导的。

  NPS1、NSP6、NPS7和NSP9等非结构蛋白也被探索为抗病毒靶标(补充表1)。然而,其潜在抑制剂的特异性和效力(主要来自药物再利用)需要进一步改进和评估。SARS-CoV-2辅助蛋白(如开放阅读框3a(ORF3a)、ORF6和ORF9b)参与多种功能,包括病毒复制、免疫逃避、自噬和/或细胞凋亡。尽管已经筛选了一些化合物来抑制SARS-CoV-2辅助蛋白(补充表1),但这些蛋白质通常是病毒生命周期的可有可无的。

  保守区域的SARS-CoV-2 RNA结构是开发核酸疗法的潜在靶标(补充表1),例如反义寡核苷酸(例如ASO4)和小干扰RNA(例如O3和C6G25S)。然而,它们的广泛应用面临着如制造等挑战。目前还没有基于RNA的抑制剂进入COVID-19试验。

  SARS-CoV-2劫持宿主因子(n300)以完成其病毒生命周期,包括ACE2等关键细胞蛋白。尽管在药物选择性和安全性方面存在局限性,但靶向保守人类蛋白质的抗病毒药物具有针对新兴变体和多种病毒的广谱活性的潜在优势。一个成功的例子是ibalizumab,这是一种FDA批准的mAb海德体育,可与T细胞表面糖蛋白CD4结合以抑制HIV-1和HIV-2多重耐药菌株的病毒侵入。本节介绍了已被探索作为抗病毒靶点以阻断SARS-CoV-2病毒侵入或复制的重要宿主蛋白(图 2).

  ACE2是某些人类冠状病毒如 SARS-CoV-2、SARS-CoV 和 HCoV-NL63的主要侵入受体(图7a)。在病毒侵入宿主细胞的初始阶段,细胞表面ACE2二聚体的N端结构域被刺突RBD识别(图7b)。SARS-CoV-2感染随后会降低ACE2表达并削弱ACE2介导的人肾素-血管紧张素系统的调节,导致肺动脉高压、炎症和心血管并发症。

  a,严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 刺突三聚体从预融合状态 (PDB: 7WEA) 到融合后状态 (PDB: 6XRA) 的结构重排。病毒侵入是通过一个预输注刺突与血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 结合而启动的,使刺突切割位点容易受到宿主蛋白酶的影响。SARS-CoV-2刺突经历了从封闭(向下)预融合状态到开放(向上)融合易发状态的广泛构象变化。随后,弗林和细胞蛋白酶(如组织蛋白酶B/L和跨膜蛋白酶丝氨酸亚家族(TMPRSS)2/13)分别切割刺突的S1/S2位点和S2′位点。

  一种潜在的治疗策略旨在通过用肽片段或迷你蛋白(如野生型人ACE2的可溶性细胞外片段APN01)模拟ACE2来阻止SARS-CoV-2进入宿主细胞。然而,在一项涉及COVID-19住院患者的II期试验中,与安慰剂对照相比,APN01在28天全因死亡率或任何有创机械通气的使用方面没有显着益处(NCT04335136)。靶向ACE2的小分子(如SB27041)也已被研究作为临床前研究中潜在的抗SARS-CoV-2药物(补充表3)。SB27041靶向ACE2的变构结合口袋,并可能诱导构象变化以阻断ACE2和SARS-CoV-2刺突之间的相互作用,而不影响ACE2酶功能。

  细胞蛋白酶,例如弗林、跨膜蛋白酶丝氨酸 2 (TMPRSS2)、组织蛋白酶、ADAM10 和 ADAM17,裂解和主要 SARS-CoV-2 刺突病毒侵入。SARS-CoV-2病毒粒子与宿主细胞的膜融合依赖于病毒突刺的蛋白水解裂解,这一过程分为两步(图7a):首先,在S1 / S2位点(684AR↓SV687)处进行弗林介导的切割,以释放受体结合亚基S1和膜融合亚基S2;其次,位于膜融合亚基 S2 内的 S2′ 位点 (814KR↓SF817) 的蛋白水解切割,以释放锚定宿主细胞膜 的刺突融合肽。S2′位点的切割在快速细胞 - 膜融合173或内体组织蛋白酶(主要是组织蛋白酶B和L)期间由TMPRSS2或TMPRSS13处理。奥密克戎在人支气管中快速复制,但致病性较低,可能是因为奥密克戎刺突对组织蛋白酶介导的内体进入的偏好发生了改变。

  甲磺酸卡莫司他和甲磺酸萘莫司他在日本获批用于治疗胰腺炎等非感染性疾病,是靶向TMPRSS2以阻断SARS-CoV-2膜融合的口服丝氨酸蛋白酶抑制剂(图7b)在细胞培养和动物模型中。然而,两项双盲随机安慰剂对照试验独立显示甲磺酸卡莫司他对COVID-19住院成人没有临床益处(NCT04657497,NCT04321096)。另外两项开放标签随机对照试验也一致报告甲磺酸萘法莫司他对 COVID-19 住院患者没有益处(NCT04623021、NCT04473053)。其他TMPRSS2抑制剂(如N-0385、阿沃拉司他、MM3122)、组织蛋白酶L抑制剂(如E-64d、K777和Z-FY-CHO)和弗林抑制剂(如癸酰-RVKR-CMK)可能抑制刺突切割,以抑制细胞培养和/或动物模型中的SARS-CoV-2复制(补充表3)。然而,靶向单个细胞蛋白酶的抗病毒抑制剂的应用仍然是一个挑战,因为SARS-CoV-2以细胞类型依赖的方式使用多种侵入途径。一般来说,细胞蛋白酶的单蛋白阻断可能不足以完全抑制病毒,而多种蛋白酶抑制剂的组合通常会导致严重的毒性。

  除ACE2和细胞蛋白酶外,许多宿主蛋白如法尼醇X受体、含溴结构域的蛋白,半胱天冬酶-6, CD147 ,线F已被探索用于开发抗SARS-CoV-2药物(补充表3)。大多数此类药物处于临床前开发阶段,少数已进入临床试验。Sabizabulin是一种具有潜在抗病毒和抗炎活性的微管干扰物,在一小群因中度至重度COVID-19住院的高危成人中,在第15、29和60天降低了全因死亡率。Meplazumab是一种人源化抗CD147 IgG2 mAb,加上标准护理,在一项针对重症COVID-19住院患者的II/III期研究中降低了29天的死亡率和病毒载量。理论上,靶向保守宿主蛋白的抑制剂克服了耐药性,但其有效性和安全性需要评估。宿主靶向抑制剂的未来开发可能集中在病毒生命周期不可或缺的宿主蛋白上。

  SARS-CoV-2感染可诱发功能失调的免疫反应和侵袭性炎症反应,通常与严重症状有关,包括致命的全身炎症、细胞因子风暴、多器官损伤和急性呼吸窘迫综合征。已广泛探索重新利用各种市售的免疫调节剂和抗凝剂以及一些研究药物,以减轻 COVID-19 患者的功能失调反应。然而,这些药物中的许多在临床试验中没有产生有意义的有益效果(补充表4),本节重点介绍那些有确凿证据的药物。COVID-19背景下药物再利用的局限性将在后面讨论。

  全身性是广泛可用且负担得起的抗炎和免疫抑制药物,用于治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病。可分为糖皮质激素(如、氢化可的松、龙和甲泼尼龙)和盐皮质激素(如氟氢可的松)。前者发挥抗炎作用和免疫调节,对重症 COVID-19 住院患者具有临床益处。后者与细胞盐皮质激素受体结合以调节盐和水的平衡 ,可能对COVID-19结果没有有益影响。

  和氢化可的松现在被推荐,主要用于正在接受氧气支持的COVID-19住院患者。是第一个在重症 COVID-19 住院患者中发现具有临床益处的糖皮质激素。COVID-19 爆发后不久,恢复研究表明,显着降低了需要呼吸支持的 COVID-19 住院患者的 28 天死亡率。单独使用或与托珠单抗和抗病毒药物联合使用有益于治疗中度至重度或危重度COVID-19。然而,在不需要呼吸支持的住院患者中没有观察到这种益处,甚至增加了严重COVID-19住院患者发生严重药物相关不良事件的风险。与全身给药不同,吸入性糖皮质激素如布和环索奈德在随机临床试验中表现出不一致的结果。

  已知全身性治疗会引起严重的不良反应,例如骨质疏松症,肾上腺抑制,心血管疾病和高血糖症,特别是长时间使用高剂量时。事实上,治疗是治疗 COVID-19 的一把双刃剑,因为它的免疫抑制特性可能有害地抑制人类的抗病毒免疫反应,尤其是在疾病进展的早期。进一步的研究需要解决全身性糖皮质激素在COVID-19患者中的最佳剂量和治疗时机,因为它们的益处可能取决于药物启动的时间、剂量和COVID-19的严重程度。

  Janus激酶(JAK1,JAK2,JAK3,酪氨酸激酶2)属于受体相关酪氨酸激酶家族,其通过激活JAK-STAT信号通路和转录调节来调节免疫反应,以响应细胞外细胞因子,干扰素和生长因子。巴瑞替尼和托伐菌素等JAK抑制剂已被批准用于治疗类风湿性关节炎等免疫介导的炎症性疾病,因此很容易用于药物再利用以减少炎症和抑制COVID-19相关的免疫失调。

  2022年5月,FDA批准了巴瑞替尼用于需要氧气支持的COVID-19住院成人的新适应症(表1)。美国国立卫生研究院和美国传染病学会 (IDSA) 指南建议在特定条件下对重症或危重症 COVID-19 住院患者口服巴瑞替尼(如果巴瑞替尼不可用,托伐菌素是另一种选择)加全身性糖皮质激素(如)(框 1)。巴瑞替尼在COVID-19住院患者中的有效性和安全性已在随机III期试验中得到证实,例如RECOVERY 207,COV-BARRIER和ACTT-2。RECOVERY和COV-BARRIER都报告了巴瑞替尼在降低28天全因死亡率方面的益处。在瑞德西韦的基础上加用巴瑞替尼在缩短恢复时间和28天全因死亡率方面优于单独使用瑞德西韦。凭借既定的安全性,巴瑞替尼为COVID-19住院患者,尤其是老年人提供了潜在的益处。托伐菌素的有效性和安全性在 289 名主要接受糖皮质激素治疗的住院成年人的 STOP-COVID 试验中得到证实。托伐菌素组到第28天的死亡或呼吸衰竭发生率低于安慰剂组,尽管这项研究不能检测到死亡率的差异。短期使用托伐菌素和巴瑞替尼不太可能与血栓形成、继发感染和免疫抑制等脱靶效应有关。

  其他 JAK 抑制剂,如福斯塔替尼、奈舒替尼、芦可替尼和帕克替尼已在 COVID-19 试验中进行了评估。一项针对59名住院患者的II期试验显示了fostamatinib(NCT04579393)的临床益处,一项III期试验(NCT04629703)正在进行中。Nezulcitinib(TD-0903)在一项针对235名重症COVID-19住院患者的II期试验中降低了28天的全因死亡率(NCT04402866)。与安慰剂加标准护理相比,芦可替尼加标准护理在III期RUXCOVID试验(NCT04362137)中对COVID-19住院患者没有临床益处。III期PRE-VENT研究报告称,在重症COVID-19住院患者中,帕克替尼与安慰剂相比没有显着益处(NCT04404361)。总体而言,仅用JAK抑制剂不足以治疗COVID-19,JAK抑制剂治疗的最佳时机需要进一步研究。

  已有20多种白细胞介素或白细胞介素受体拮抗剂获得批准,主要用于治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病(补充表5)。阻断促炎细胞因子(如IL-6)及其受体是一种可能的治疗策略,可减少COVID-19患者的侵袭性炎症反应并减轻细胞因子释放加剧。在一长串细胞因子和趋化因子中,IL-6 已被公认为与 COVID-19 严重程度 密切相关的多效性细胞因子。重新利用 IL-6 受体拮抗剂(如托珠单抗)从而减少炎症反应并改善 COVID-19 住院患者的临床结果。基于RECOVERY试验(见相关链接),该试验涉及4,116名基线时缺氧和全身炎症的COVID-19住院患者,在标准治疗中加入托珠单抗(82%的病例使用糖皮质激素)改善了28天的出院时间,降低了28天的全因死亡率,并降低了达到有创机械通气或死亡复合终点的患者百分比。然而,在一项针对重症 COVID-19 肺炎住院患者的 III 期试验中,与标准治疗相比,托珠单抗加标准治疗(仅 19% 的病例同时使用糖皮质激素)并未降低 28 天死亡率。2021年6月,托珠单抗被FDA授予EUA,用于治疗接受全身性并需要补充供氧的COVID-19住院患者(表1)。

  除托珠单抗外,许多细胞因子拮抗剂已在 COVID-19 试验中进行了评估。一项名为 REMAP-CAP的随机平台试验表明,IL-6 受体拮抗剂沙利鲁单抗与安慰剂或标准治疗相比具有临床益处,而在沙利鲁单抗 COVID-19 (NCT04315298) 和沙利鲁单抗 COVID-19 全球研究 (NCT04327388) 中没有沙利尤单抗的附加值。在 REMAP-CAP 研究中,在 COVID-19 住院期间接受 sarilumab 或托珠单抗的重症监护病房中重症成人的 180 天全因死亡率降低Clazakizumab 是一种实验性 IL-6 拮抗剂,可改善 COVID-19 过度炎症住院患者的临床结果。

  Anakinra是一种IL-1受体拮抗剂,在SAVE-MORE(NCT04680949)中降低了COVID-19住院患者的28天全因死亡率和住院时间,但在REMAP-CAP(NCT02735707)和CORIMUNO-ANA-1(NCT04341584)中未能显示出临床益处。三种抑制粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的实验性mAb也观察到了不同的结果:LIVE-AIR 218中的lenzilumab,BREATHE中的gimsilumab和CATALYST中的namilumab。卡那单抗(一种IL-1β拮抗剂)和苏金单抗(一种IL-17拮抗剂)在重症住院患者中的临床益处分别在随机试验CAN-COVID和BISHOP中没有显示。CERC-002是一种人抗LIGHT单克隆抗体,在一项针对COVID-19相关肺炎和轻度至中度急性呼吸窘迫综合征住院患者的小型研究中降低了LIGHT细胞因子的血清水平(NCT04412057)。在III期ACTIV-1 IM研究(NCT04593940)中,肿瘤坏死因子拮抗剂英夫利昔单抗降低了28天的全因死亡率并改善了14天的临床状态。

  为什么IL-6拮抗剂提供临床益处,而其他白细胞介素拮抗剂似乎效果较差?这可能是因为重度至危重度 COVID-19 患者的 IL-6 浓度升高,但其他白细胞介素则较低。然而,应根据血清细胞因子水平,细胞因子阻断的时间和最佳剂量密切监测IL-6(受体)拮抗剂的施用。

  I型干扰素,如干扰素-α(IFNα)和IFNβ,以其在抗病毒感染的抗病毒免疫反应中的重要作用而闻名。聚乙二醇化的IFNα-2a/2b和IFNβ-1a已被批准用于治疗肝炎感染和复发型多发性硬化症,5。早期用IFNβ-1b加瑞德西韦治疗可缩短高危患者的病毒排出和住院时间。在COVID-19门诊患者的III期TOGETHER研究中,Peg-IFNλ-1a降低了住院或急诊就诊的发生率,而IFNβ-1a在降低COVID-19住院患者的总体死亡率、通气开始或住院时间方面没有益处。对于基线时需要高流量氧气的住院患者,IFNβ-1a甚至增加了呼吸衰竭等不良反应的频率。

  非甾体抗炎药可被视为辅助治疗,以减轻SARS-CoV-2诱导的过度炎症,从而可能降低进展为重症COVID-19的风险。拓扑替康是FDA批准的抗癌化合物,可抑制人拓扑异构酶1以抑制SARS-CoV-2诱导的动物模型中的致命炎症,并且正在一项I期研究(NCT05083000)中进行评估。Vilobelimab是一种抗C5a单克隆抗体,可阻断C5a–C5aR1信号轴以减轻炎症和凝血,在III PANAMO研究233中,降低了机械通气COVID-19住院患者的28天全因死亡率。2023 年 4 月,FDA 批准在 COVID-19 住院成人中紧急使用维洛贝利单抗,前提是在氧气支持后 48 小时内开始。

  许多 COVID-19 患者,尤其是重症患者,发生静脉血栓栓塞的风险很高,与不良的临床结果相关,甚至死亡。虽然抗凝剂不能抑制SARS-CoV-2复制,但已评估使用阿哌沙班、依诺肝素和利伐沙班等抗凝剂的治疗和预防性使用可减少COVID-19住院患者的血栓栓塞。在一项包含 2,219 名非危重住院患者的大规模随机试验中,低分子量肝素与常规治疗相比,减少了心血管或呼吸器官支持的使用,提高了出院的生存概率。COVID-19住院患者出院后,利伐沙班10mg每日35天也改善了静脉血栓栓塞风险增加的患者的主要结局。然而,在接受阿哌沙班 238、依诺肝素或利伐沙班 的 COVID-19 门诊患者中,血栓预防无效。此外,III 期 INSPIRATION 试验不支持在重症监护病房 241 收治的未经选择的 COVID-19 住院患者中每天常规预防性使用依诺肝素 1 mg kg−1海德体育。

  肝素的净效果可能取决于患者状态、疾病严重程度和治疗开始时间,但对于临床使用低分子量肝素来降低某些(非妊娠、非重症监护病房)COVID-19住院患者血栓栓塞和出血并发症的风险,人们的共识越来越多。依诺肝素是首选的低分子量肝素,可减少中危 COVID-19 住院患者的血栓栓塞。抗凝剂的最佳剂量和给药时机需要进一步检查。

  迄今为止,已有10多种抗病毒药物上市用于COVID-19治疗(表1)。抗病毒药物的治疗窗口可能仅限于SARS-CoV-2感染的病毒期(图8)。对于轻至中度 COVID-19 门诊患者,需要早期抗病毒治疗以降低进展为重症 COVID-19 的风险。然而,目前上市的抗病毒药物,除了口服nirmatrelvir-ritonavir和molnupiravir,通常在医院和输液中心通过注射给药,限制了其在门诊和资源有限的环境中的实际给药。除抗病毒药物外,对乙酰氨基酚(扑热息痛)等非处方药也可有效缓解发烧等COVID-19症状,尽管它们不能消除冠状病毒。

  a,2019年冠状病毒病(COVID-19)不同阶段的治疗干预措施。在感染前阶段,可以考虑使用防变异株疫苗、暴露前预防和非药物干预。一旦诊断出严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染,最好尽快对门诊患者进行抗SARS-CoV-2治疗,以便在早期阶段显著降低病毒载量。SARS-CoV-2病毒载量通常在症状发作(SO)后的第一周内达到峰值,SARS-CoV-2 RNA在上呼吸道脱落的平均持续时间约为17天。抗SARS-CoV-2免疫球蛋白M(IgM)、IgG和中和抗体的水平分别在约20、25和31天达到峰值。在COVID-19进展的晚期阶段,可考虑在某些条件下对重症或危重症住院患者使用免疫调节剂、抗凝剂、抗炎药和/或重症监护(框注1)。对于一些在COVID-19感染后出现持续症状的幸存者,可能需要感染后干预。慢性阻塞性肺病,慢性阻塞性肺病;单克隆抗体、单克隆抗体;Mpro,主要蛋白酶;RdRp,RNA依赖性RNA聚合酶。

  在COVID-19的早期阶段,由于抑制免疫反应和增加病毒载量,使用抗炎药和免疫调节剂治疗可能是有害的。但对于重症或危重症COVID-19住院患者,使用抗病毒药物加免疫调节剂、抗凝剂和/或抗炎药等支持性干预措施可能会产生协同效益(表1)。例如,和瑞德西韦为需要氧气支持的住院患者提供了协同益处。然而,应谨慎评估药物间的相互作用,因为经常使用许多抗病毒和非抗病毒药物,特别是对于已有疾病的重症成人。至少在病毒感染期间,应停止预先存在的某些药物,例如增加人类对SARS-CoV-2感染247易感性的mTOR抑制剂。

  抗病毒药物耐药性通常由药物结合口袋中的氨基酸取代诱导,这对开发针对SARS-CoV-2变体的强效抗病毒药物构成了挑战5。由于奥密克戎变异株赋予耐药性,不再推荐临床使用许多单克隆抗体(表1)。一些突变可能赋予对nirmatrelvir(如E166V)和瑞德西韦(如V792I)的耐药性。这些突变目前在全球SARS-CoV-2分离株中的患病率较低,但应特别注意高危人群,例如长时间高滴度SARS-CoV-2的严重免疫功能低下患者。根据从HIV和HCV疗法中吸取的经验教训,有可能开发双药或三药组合(例如聚合酶抑制剂和蛋白酶抑制剂加药代动力学加强剂),以有效抑制多种病毒靶标,以最大限度地提高疗效机会并降低耐药性风险,尽管必须评估药物相互作用和累积的不良反应这种联合治疗提供额外临床益处的潜力需要研究。

  鉴于确定 COVID-19 疗法的紧迫性以及传统药物开发的典型冗长时间表,药物再利用——包括筛选最初为其他人类疾病开发的已批准药物或临床阶段候选药物——已被广泛追求,以确定抑制 SARS-CoV-2 或减轻病毒感染后果的药物。希望对PK / PD和安全概况,交付路线和再利用候选人的配方的先验知识可以加速和降低其发展风险。药物再利用在概念上具有吸引力,以应对紧急爆发,但其实施面临挑战。在此,我们强调从迄今为止的重新调整用途工作中吸取的经验教训。

  首先,在临床前和临床研究中必须严格评估重新利用的候选药物(图9),特别是当重新利用给定候选药物(例如羟氯喹)的生物学原理尚不清楚时。在某些情况下,当原始应用和新应用之间的药物作用的主要机制相似时,理由可能相对较强。例如,重新利用瑞德西韦和莫努匹拉韦等RNA聚合酶类核苷(酸)药物来抑制病毒RNA合成有望获得相对较高的成功概率,但鉴定逃避SARS-CoV-2校对机制的核苷酸类似物仍然需要反复试验。相比之下,重新利用替诺福韦等DNA聚合酶抑制剂来抑制SARS-CoV-2的RNA合成注定要失败,因为它们的作用机制不同。此外,由于 HIV 和 SARS-CoV-2 蛋白酶中的药物结合口袋之间缺乏相似性,因此不应将洛匹那韦等 HIV 蛋白酶抑制剂重新用于 SARS-CoV-2 治疗 。除替诺福韦、利巴韦林和拉米夫定等核苷(酸)抑制剂外,其他病毒靶向抑制剂尚未被FDA批准用于治疗一种以上的传染病。它们不是很好的再利用候选者,因为它们的化学结构通常被设计为以高选择性靶向特定的药物结合口袋,因此它们不太可能对不相关的靶标具有相似的效力水平。重要的是,诱导磷脂沉着的阳离子两亲性药物(如羟氯喹、阿奇霉素和胺碘酮)不应被重新利用,因为细胞磷脂增生经常被误解为抗病毒功效。

  潜在或已宣布暴发的早期阶段需要立即进行非药物干预,以防止病原体传播。基因组测序可用于鉴定冠状病毒毒株,指导疫苗和抗病毒药物的临床使用和/或开发。图中显示了抗病毒开发所涉及的步骤,这些步骤通常从靶标和靶点识别到临床前开发、临床评估以及药物授权和上市。ACE2,血管紧张素转换酶2;APN,氨基肽酶N;CC50,半最大细胞毒性浓度;DPP4,二肽基肽酶4;EC50,半最大有效浓度;HCoV,人类冠状病毒;IC50,半最大抑制浓度;重症监护室,重症监护室;随机对照试验,随机对照试验。

  其次,我们建议未来的再利用工作集中在符合以下标准的候选药物上:具有合理治疗原理的明确定义的分子作用机制;对所设想的目标具有高度特异性;来自合适的疾病模型和/或临床案例研究的稳健临床前研究的强有力的初步活性证据;以及无严重毒性(或者如果发生毒性,应可补救)。理想情况下,重新利用的抑制剂应具有较低的耐药性可能性,或者如果出现耐药性,则应是可以解决的。具有多种生物活性的已批准或临床阶段药物的大型文库可能有助于抗病毒药物筛选,但目前缺乏此类开放获取文库。

  第三,考虑到大多数接受COVID-19检测的再利用候选药物未能显示出临床益处,在获得强有力的证据之前,应采取预防措施,避免超说明书使用现有药物。未能在 COVID-19 试验中显示出显着临床益处的候选药物包括但不限于针对其他病毒开发的各种药物,例如洛匹那韦-利托那韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦艾拉酚胺、恩曲他滨、巴洛沙韦马波西尔、索非布韦、达卡他韦和维帕他韦;以及针对其他人类疾病开发的广泛疗法,例如(羟基)氯喹、乙酰半胱氨酸、同种异体间充质细胞、阿司匹林、阿托伐他汀、阿米特林、醋酸阿维普地尔、阿奇霉素、甲磺酸卡莫司他、阿斯特戈利单抗、布伦索卡替、卡那单抗、吉姆西鲁单抗、西尔妥昔单抗、奥替利单抗、环索奈德、氯吡格雷、秋水仙碱、达格列净、糠酸氟替卡松、氟伏沙明、依夫马多康星α、伊马替尼、伊维菌素、二甲双胍、尼古丁、硝唑尼特、吡非尼酮、氯沙坦、替卡格雷洛、 替米沙坦,维生素C,维生素D3和葡萄糖酸锌(补充表4)。

  根据我们广泛的搜索,据报道,许多药物(n = 712)在临床前和/或临床研究中具有抗SARS-CoV-2活性(补充表1到3)。这些药物大多是小分子(53%),其次是抗体(33%)、肽抑制剂(4%)和其他(如大分子抑制剂、基于RNA的疗法8和基于细胞的疗法)。大多数药物(90%)尚未进入临床试验,在大多数情况下仍需要优化先导化合物。

  我们重点介绍了九种病毒蛋白(刺突、核衣壳、木瓜蛋白酶样蛋白酶、NSP5、NSP12 至 NSP16)中的药物结合口袋。木瓜蛋白酶NSP16,NSP14外切核糖核酸酶和NSP12 NiRAN的结构分析揭示了人类的同源蛋白,引发了对靶向它们的潜在药物的毒性问题。相比之下,NSP5主蛋白酶NSP12 RdRp和NSP15内切核糖核酸酶具有药物结合口袋,在人类蛋白质中没有同源结构,使其成为开发高特异性和低毒性小分子抑制剂的有希望的靶标。到目前为止,NSP5和NSP12 RdRp的小分子抑制剂已被授权。刺突和核衣壳等结构蛋白经历动态结构重排,因此对开发小分子抑制剂提出了挑战。抗刺突单克隆抗体已成功开发,但由于奥密克戎等SARS-CoV-2变异株的出现,大多数单克隆抗体的疗效受到影响。

  从理论上讲,有可能开发泛冠状病毒抑制剂,靶向具有多种冠状病毒高度保守序列和结构的药物结合口袋。临床前研究表明,瑞德西韦、莫努匹拉韦和6-72-2a等NSP12抑制剂在细胞培养和/或动物模型中具有泛冠状病毒潜力。Mpro抑制剂如nirmatrelvir,ensitrelvir和GC376可能具有广谱特征,尽管其中一些对甲冠状病毒(HCoV-229E,HCoV-NL63)的活性低于β冠状病毒(SARS-CoV,SARS-CoV-2,MERS-CoV)。根据过去几十年抗病毒药物发现的经验教训。模仿天然核苷酸(t)ides以抑制病毒合成的核苷(酸)类似物具有强大的泛冠状病毒抑制潜力。未来努力扩大具有适合临床试验特性的泛冠状病毒制剂库是值得的。

  成功的抗病毒开发需要适当的细胞系(如人气道上皮细胞)、体外测定(如多周期病毒中和测定)和动物攻击模型(如转基因小鼠、仓鼠和恒河猴)。SARS-CoV-2主要感染人肺中的纤毛细胞和2型肺细胞; 因此,分化的原代气道上皮细胞是一个很好的模型,但它们在细胞培养中的有限增殖寿命需要改进。非洲绿猴肾细胞系Vero E6是一种流行的细胞系,支持SARS-CoV-2复制,但非人细胞系不足,特别是用于筛选抗病毒前药,例如需要在人类细胞中代谢激活的核苷(酸)抑制剂。有一些值得注意的例子,例如氯喹和伊维菌素——这两种重新利用的药物已被证明对 COVID-19 患者没有临床益处(补充表4)——最初提出临床试验是基于它们对 SARS-CoV-2 在 Vero E6 细胞中的抑制作用 。然而,它们有限的抗SARS-CoV-2活性随后在人Calu-3肺细胞中得到证实,这强调了使用适当的细胞系进行抗病毒筛选的重要性。标准化的实验室方案和检测,理想情况下为每个病毒家族建立,对于避免假阳性结果非常重要。此外,应建立生物安全实验室进行病毒检测和抗病毒筛查,因为缺乏此类实验室可能是大流行早期阶段的瓶颈。

  在过去的 3 年中,数百种药物已在 10,000 多项 COVID-19 注册临床试验中进行了测试。然而,大多数试验缺乏随机化和/或足够的把握度来提供高质量的有效性和安全性证据,而且许多试验是重复的。一些小规模试验报告的结果与羟氯喹等药物相矛盾,导致资源浪费和潜在毒性。许多试验的设计没有获得监管机构认可的适当临床终点(框1),或者由于自我隔离、旅行限制和出现具有不同疾病进展模式和严重程度的新变异等困难,无法满足协议规定的程序。

  在大流行期间快速发展的背景下,常规临床试验的建立面临着诸如缺乏改变干预措施的灵活性、难以招募足够患者和资源有限等挑战。值得注意的是,许多最有用的临床结果是通过平台试验确定的,这些试验解决了传统试验的一些局限性。这些大规模的长期随机平台试验,如RECOVERY、Solidarity和REMAP-CAP(见相关链接),使用一个主方案同时评估针对一个共同对照组的多种干预措施,并具有添加新干预措施和更新对照组的灵活性。正在进行的 RECOVERY 试验成立于 2020 年 3 月,是最成功的平台试验之一,招募了 50,000 多名 COVID-19 患者,以提供关于、巴瑞替尼、托珠单抗和卡西利单抗-伊德维单抗有效性的里程碑式证据。它还证明羟氯喹、洛匹那韦-利托那韦、阿奇霉素、阿司匹林、恢复期血浆、秋水仙碱和富马酸二甲酯对 COVID-19 患者缺乏疗效。恢复的成功取决于中心随机化;广泛、简单的纳入标准;全因死亡率的简单、明确的主要结局;没有外来数据或生物样本收集,以及国家支持和预先存在的临床试验网络。

  许多患者经历了SARS-CoV-2感染的长期影。